Erforschung neuartiger Laserlichtquellen

Die AG Karpf forscht an der Entwicklung neuartiger Laserlichtquellen und deren Einsatz in der biomedizinischen Bildgebung. Die jüngst entwickelte SLIDE-Mikroskopie ermöglicht schnellste Bildgebung in der nichtlinearen Zweiphotonenmikroskopie, bei der Bildwiederholraten von 2kHz und mehr erreicht werden. Solch schnelle Aufnahmegeschwindigkeiten gepaart mit der molekularen Spezifizität von Fluoreszenzmarkern und der hohen optischen Auflösung im sub-µm Bereich erlauben das Beobachten von schnellsten biologischen Vorgängen bis hinab in das Innere der Zellen. Eine Anwendung, die zukünftig mit dem SLIDE-Mikroskop an der Universität zu Lübeck verfolgt werden soll, ist die bildgebende Flusszytometrie, bei der binnen kürzester Zeit hunderte von Tausenden von Zellen bildgebend und multi-modal untersucht werden um extrem seltene Zellen, wie z.b. zirkulierende Tumorzellen, unter einer Vielzahl von gesunden Zellen zu diagnostizieren.

Schematischer Aufbau des SLIDE Mikroskops: Spectro-Temporal Encoding für schnellste Bildgeschwindigkeiten im multi-kHz Bereich und hohe Aufnahmebandbreiten ermöglichen die Extraktion von FLIM Daten.
Oben links: Die Zeilen werden mit der Wellenlänge über ein Beugungsgitter abgetastet. Rest: Bildergebnisse des SLIDE Mikroskops (links TPEF, rechts FLIM). Die hohe, beugungsbegrenzte Auflösung im sub-µm Bereich ist erkennbar an den „Stacheln“ der fluoreszenzgefärbten Pollen.

SLIDE Mikroskopie

Das SLIDE Mikroskop wurde von Sebastian ‚Nino‘ Karpf an der UCLA, Kalifornien entwickelt, um schnellste biologische Vorgänge mittels nichtlinearer Zweiphotonenmikroskopie sichtbar zu machen. Moderne Zweiphotonenmikroskope verwenden galvanometrische Scanspiegel, die Zeilengeschwindigkeiten von ca. 20.000 Linien pro Sekunde erreichen. Diese Geschwindigkeiten sind limitiert durch das Trägheitsmoment der sich bewegenden Spiegel und können daher nicht beliebig erhöht werden. Will man zu schnelleren Scangeschwindigkeiten, muss man trägheitsfreie Scanverfahren verwenden. Das SLIDE-Mikroskop erreicht um Größenordnungen höhere Zeilenscangeschwindigkeiten indem es einen schnell wellenlängenabstimmbaren Laser einsetzt und diesen mittels einem Beugungsgitter ablenkt. Damit werden trägheitsfreie Scangeschwindigkeiten von MHz und mehr erreicht. Einen weiteren Vorteil bietet die schnelle Datenacquisition, die es ermöglicht auch transiente Fluoreszenzabklingkurven aufzunehmen und so mittels FLIM-Bildgebung auch Informationen aus der molekularen Umgebung der Fluoreszenzfarbstoffe zu extrahieren. Diese Multi-Modalität wird aus den selben Messdaten extrahiert, weshalb beide physikalischen Informationskanäle – TPEF und FLIM – mit der selben schnellen Bildwiederholrate von 2kHz und mehr aufgenommen werden.

Der Aufbau des Mikroskops inklusive wichtiger gemessener Kenngrößen des Systems.
Imagingergebnisse der SLIDE Flusszytometrie von fluoreszenzgefärbten Kunststoffkügelchen bei einer Flussgeschwindigkeit von 0.2 m/s oder zehntausenden Kügelchen pro Sekunde.

Diese Visualisierung veranschaulicht gut das Phänomen der Fluoreszenzlebenszeit, da zum Zeitpunkt 0ns der Anregungslichtimpuls auf die Probe geschickt wird und in der Folgenden Zeit unterschiedliche Teile der Polle das Leuchten (Fluoreszenz) anfangen und danach noch unterschiedlich lange Licht aussenden. Die Auswölbung unten links weist dabei die längste Fluoreszenzlebenszeit auf. Die Messung der Fluoreszenzlebenszeit erfolgte mittels SLIDE-Mikroskopie bei schneller Datenerfassung von 6,25 GSamples/s, einer Pixelrate von 176 MHz und einer Bildaufnahmegeschwindigkeit von 1ms pro Bild. Das hier dargestellte Video wurde aus 100 Aufnahmen gemittelt, was eine Gesamtaufnahmedauer von 100ms ergibt.

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